Transporte directo de ADN en protoplastos. Los protoplastos son las estructuras ideales para la transferencia de genes ya que el ADN tiene libre acceso a las membranas plasmaticas libres y a todos los receptores libres en una población, y además cada protoplasto ha pasado por un procedimiento de aislamiento. Es decir los protoplastos son capaces de captar ADN, sin embargo esto es estimulado por la presencia policationes (poli L-lisina, poli-L-ornitina); por iones de Ca++, Mg++ o Zn++; o por un tratamiento con PEG (polietileno glicol), los cuales actúan como agentes protectores estimulando la compactación y agregación del ADN.
Electroporación. Hoy día es la técnica más utilizada para la transformación de protoplastos debido a su eficiencia. Se realiza por medio de la aplicación de un toque de corriente al protoplasto, el cual temporalmente abre los poros de sus membranas celulares, permitiendo así la entrada de moléculas de ADN.
Electroforesis. Si bien la electroforesis representa otra forma de transferir genes foráneos, Potrykus (1991) explica que ha sido escasamente utilizada debido a que en los ensayos realizados no se han obtenido pruebas de una transformación integrativa. De acuerdo a los autores Kahl y Weising (1993), la transferencia de genes por electroforesis consiste en suspender los protoplastos o células a utilizar en una microgota entre el ánodo y el cátodo, siendo el ADN electroforisado a través de las membranas.
Bombardeo con partículas. Es una técnica reciente y prometedora. Esta basada en la introducción de macromoleculas de ADN cubiertas de oro o tungsteno en células y tejidos intactos por medio de microproyectiles a alta velocidad.
La utilización de esta técnica ha permitido la transformación de variedades vegetales de importancia económica como el Sorghum vulgare las cuales son recalcitrantes a la transformación por medio de Agrobacterium. El empleo de este método presenta algunas ventajas sobre los demás como ser su facilidad de manejo, un solo disparo puede transferir genes a muchas células, los genes que se encuentran biológicamente activos en la macropartícula, este depende únicamente de parámetros físicos. Logrando así transportar genes a muchas células cerca de la posición deseada sin que implique un gran esfuerzo manual.
Técnica de microondas láser. Consiste en lo siguiente: una microonda de rayos UV-láser es enfocada en la vía lumínica de un microscopio, permitiendo así la perforación de las paredes y membranas celulares de las células, con lo cual al conservarlas en un medio plasmolisante, se facilita la toma de ADN foráneo en las células o cloroplastos. Sin embargo a pesar de que se ha logrado la transferencia de ADN, esta técnica presenta algunas desventajas frente a otras técnicas tales como su alto costo y su menor precisión por lo que su uso se ve limitado.
Microinyección. Esta a pesar de haber sido originalmente desarrollada para la inyección de macromoléculas en células animales, esta siendo también utilizada para la obtención de plantas transgénicas. Esta técnica permite la inyección de ADN, en protoplastos y embriones (siendo entonces una solución para los problemas que se presentan en la transformación de cereales), permitiendo así obtener, a partir de la primera generación, plantas transgénicas de origen clonal. Otra ventaja que se pueden considerar al utilizar esta vía es la posibilidad de que la cantidad de ADN a entregar sea optimizada, asimismo se puede decidir en cual célula se dejara el ADN es decir su entrega es precisa y predecible. Este método no obstante el éxito obtenido presenta algunas desventajas como lo son el que solo una célula recibe ADN por inyección, además su manejo requiere una mayor pericia e instrumentación.
Para poner en práctica la microinyección se puede utilizar:
- una inyección capilar conteniendo el ADN transformado y un soporte en el cual los protoplastos o células son temporalmente inmovilizados para su inyección.
- una inyección capilar trabajando conjuntamente con una "capilaridad sostenida", la que es utilizada para fijar la célula o protoplasto, para una efectiva inyección de ADN.
Macroinyección. En contraste con la microinyección esta utiliza para transportar el ADN a los tejidos, jeringas de inyección normales con agujas mucho más anchas que el diámetro de la célula con lo que el ADN debe transportarse a través de las membranas plasmaticas y paredes celulares de las células adyacentes al sitio herido provocando una gran perdida de ADN, con lo que podemos concluir que esta técnica no es muy efectiva en la transferencia de genes y por consiguiente no muy utilizada.
Fusión de liposomas. Esta a pesar de ser una técnica establecida para la producción de plantas transgénicas, no se utiliza mucho debido a que no presenta mayores ventajas sobre las demás técnicas de transferencia directa de genes.
Inyección de liposomas. En este procedimiento se combinan la encapsidación liposómica y la microinyección para tratar de destruir la fusión de liposomas con la membrana del tonoplasto para una entrega segura del ADN a la célula. Sin embargo a pesar de que se ha realizado la fusión de células de diferentes cultivos (maíz, tabaco, arroz y zanahoria), el gen trasladado no se ha expresado en ninguno de los casos. Por lo que la microinyección directa de ADN en el núcleo de la célula es preferida ante la inyección liposómica.
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